الکتروفورز ژل: جداسازی قطعات DNA بر اساس اندازه
DNA و نیاز به جداسازی آن
اسید دئوکسی ریبونوکلئیک2 یا DNA، مولکول حاوی اطلاعات ژنتیکی همه‌ی موجودات زنده است. گاهی اوقات، دانشمندان نیاز دارند تا یک نمونه DNA را که حاوی قطعاتی با اندازه‌های مختلف است، تجزیه و تحلیل کنند. برای مثال، پس از برش DNA توسط آنزیم‌های خاصی به نام آنزیم‌های برشی3، مخلوطی از قطعات با طول‌های متفاوت به دست می‌آید. الکتروفورز ژل روشی است که این قطعات را بر اساس اندازه از هم جدا می‌کند.
می‌توان این فرآیند را به مسابقه‌ای تشبیه کرد که در آن دونده‌های سنگین‌وزن و سبک‌وزن در یک زمین گل‌الی شرکت می‌کنند. دونده‌های سبک‌تر (قطعات کوچک‌تر DNA) راحت‌تر و سریع‌تر در گل پیش می‌روند، در حالی که دونده‌های سنگین‌تر (قطعات بزرگ‌تر DNA) کندتر حرکت می‌کنند. در پایان مسابقه، شرکت‌کنندگان بر اساس سرعت و مسافت طی‌شده در خطوط مختلفی قرار می‌گیرند.
اجزای اصلی یک دستگاه الکتروفورز ژل
برای انجام الکتروفورز ژل، به چند جزء کلیدی نیاز داریم. این اجزا مانند یک تیم با هم کار می‌کنند تا جداسازی انجام شود.
| نام جزء | کاربرد |
|---|---|
| محفظه الکتروفورز (تانک) | ظرفی پلاستیکی که ژل و محلول بافر در آن قرار می‌گیرد. |
| ژل (معمولاً آگارز) | ماده‌ای متخلخل که مانند یک الک مولکولی عمل کرده و مسیر حرکت DNA را فراهم می‌کند. |
| بافر | مایع دارای یون که محیطی برای هدایت جریان برق فراهم می‌کند و به DNA بار منفی می‌دهد. |
| منبع تغذیه (پاور) | جریان الکتریکی با ولتاژ کنترل‌شده ایجاد می‌کند. |
| الکترودها (مثبت و منفی) | جریان برق را به درون بافر هدایت می‌کنند. |
چگونه الکتروفورز ژل انجام می‌شود؟
انجام این آزمایش شامل یک سری مراحل گام‌به‌گام و منطقی است.
گام اول: تهیه ژل
پودر آگارز را با مقدار مشخصی از بافر مخلوط و حرارت می‌دهند تا کاملاً حل شود. سپس این مایع داغ درون یک قالب ریخته شده و یک شانه در انتهای آن قرار داده می‌شود. با سرد شدن مایع، ژل جامد و شفافی تشکیل می‌شود که حفره‌هایی (چاهک‌ها) برای قرارگیری نمونه‌ها دارد.
گام دوم: بارگذاری نمونه‌ها
نمونه DNA را با یک رنگ آبی مخصوص (بارگذاری4) مخلوط می‌کنند. این رنگ نه تنها به ما کمک می‌کند نمونه را ببینیم، بلکه باعث سنگین‌تر شدن آن می‌شود تا نمونه در کف چاهک‌ها باقی بماند. سپس با استفاده از یک پیپت مخصوص، مخلوط DNA و رنگ را به داخل چاهک‌های ژل انتقال می‌دهند. در یکی از چاهک‌ها نیز نمونه‌ای با اندازه‌های شناخته‌شده از DNA به نام نردبان5 بارگذاری می‌شود تا به عنوان معیار اندازه‌گیری استفاده شود.
گام سوم: اجرای جریان الکتریکی
ژل که درون تانک قرار دارد، کاملاً با بافر پوشانده می‌شود. سپس منبع تغذیه روشن شده و جریان الکتریکی برقرار می‌شود. DNA که بار منفی دارد، شروع به حرکت به سمت الکترود مثبت (در انتهای دیگر ژل) می‌کند.
گام چهارم: مشاهده نتایج
پس از اتمام زمان اجرا (معمولاً 20 تا 40 دقیقه)، جریان قطع شده و ژل را از تانک خارج می‌کنند. برای دیدن DNA که به خودی خود نامرئی است، ژل را در محلولی حاوی یک رنگ فلورسنت (مانند اتیدیوم بروماید یا جایگزین‌های ایمن‌تر) قرار می‌دهند. این رنگ به DNA متصل شده و تحت نور ماوراء بنفش، DNA به صورت نوارها یا باند6های درخشان قابل مشاهده می‌شود. قطعات کوچک‌تر DNA که مسافت بیشتری را طی کرده‌اند، در پایین ژل و قطعات بزرگ‌تر در بالای ژل دیده می‌شوند.
یک مثال عملی: تست تشخیص والد-فرزندی
یکی از کاربردهای جالب الکتروفورز ژل، در آزمایش‌های تعیین هویت و رابطه‌ی خانوادگی است. DNA هر فرد از پدر و مادرش به ارث میرسد. اگر بخواهیم بررسی کنیم که آیا یک کودک، فرزند واقعی یک فرد خاص است یا خیر، نمونه DNA کودک، مادر و پدر ادعایی را جمع‌آوری می‌کنیم. سپس با استفاده از تکنیک‌هایی مانند PCR7، نواحی خاصی از DNA هر سه نفر را میلیون‌ها بار کپی می‌کنیم. این نمونه‌های کپی‌شده را در کنار هم روی یک ژل الکتروفورز بارگذاری و اجرا می‌کنیم. الگوی باندهای DNA کودک باید تلفیقی از الگوهای پدر و مادر واقعی او باشد. اگر باندهایی در کودک وجود داشته باشد که در الگوی پدر ادعایی نیست، می‌تواند نشان‌دهنده‌ی این باشد که آن فرد پدر بیولوژیکی کودک نیست.
اشتباهات رایج و پرسش‌های مهم
این اتفاق معمولاً به دلایل زیر رخ می‌دهد: ۱) ولتاژ اجرای خیلی بالا بوده که باعث گرم شدن بیش از حد ژل و ذوب جزئی آن شده است. ۲) مقدار DNA بارگذاری‌شده بیش از حد زیاد بوده است. ۳) ژل به خوبی جامد نشده یا کیفیت مناسبی نداشته است.
DNA که بار منفی دارد، به جای حرکت به سمت انتهای مثبت ژل، به سمت انتهای منفی و در نهایت به سمت مخزن بافر حرکت خواهد کرد و برای همیشه از چاهک‌ها خارج می‌شود. در نتیجه هیچ باندی روی ژل مشاهده نخواهد شد.
بله، اما روشی مشابه با نام "الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید"8 برای جداسازی پروتئین‌ها استفاده می‌شود. از آنجا که بار پروتئین‌ها می‌تواند متفاوت باشد، ابتدا با ماده‌ای به نام SDS9 بار همه‌ی آن‌ها را منفی و یکسان می‌کنند تا جداسازی فقط بر اساس اندازه انجام شود.
الکتروفورز ژل یک ابزار قدرتمند و در عین حال قابل درک در زیست‌شناسی مولکولی است. این روش با استفاده از یک میدان الکتریکی و یک ژل متخلخل، امکان جداسازی، مشاهده و تجزیه‌وتحلیل مولکول‌های DNA را بر اساس اندازه‌ی آن‌ها فراهم می‌کند. از تشخیص بیماری‌های ژنتیکی گرفته تا تعیین هویت در صحنه‌ی جرم، کاربردهای گسترده‌ی این تکنیک، آن را به یکی از ستون‌های اصلی آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی در سراسر جهان تبدیل کرده است.
پاورقی
1 Gel Electrophoresis
2 Deoxyribonucleic Acid
3 Restriction Enzymes
4 Loading Dye
5 DNA Ladder
6 Band
7 Polymerase Chain Reaction
8 Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)
9 Sodium Dodecyl Sulfate