آنزیم لیگاز باعث برقراری پیوند فسفودی استر بین قطعات دنا می‌شود. نوکلئوتیدهای موجود در دنا، دارای قند دئوکسی ریبوز هستند.

بررسی سایر گزینه‌ها: گزینه (1): دنای نوترکیب را به درون‌یاخته میزبان، مثلاً باکتری منتقل می‌کنند. پس اجباری بر استفاده از سلول های باکتریایی نیست. در باکتری‌ها، مولکول دنای اصلی به غشا متصل است.

گزینه (2): تبدیل دیسک حلقوی باکتری به یک قطعه دنای خطی، به کمک برش جایگاه تشخیص آنزیم توسط آنزیم برش‌دهنده صورت می‌گیرد. آنزیم برش دهنده، پیوند فسفودی استر (نوعی پیوند اشتراکی) بین نوکلئوتیدهای موجود در هر رشته را برش می‌دهد؛ اما شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته دنا در منطقه تشخیص، بدون دخالت مستقیم آنزیم رخ می‌دهد.

گزینه (4): آنزیم‌هایی که توانایی شکستن پیوندهای فسفودی استر رادارند، شامل دنابسپاراز و آنزیم برش‌دهنده هستند. آنزیم‌های برش‌دهنده در ساخت پیوندهای کووالانسی نقشی ندارد.